English МАКМАХ Мероприятия Публикации RosNet МАКМАХ / Публикации / Выявление резистентности к метициллину и другим бета-лактамным антибиотикам...

Выявление резистентности к метициллину и другим
бета-лактамным антибиотикам методом скрининга

методическое пособие

Автор

А.В. Дехнич
Институт антимикробной химиотерапии, г. Смоленск

Рецензенты

А.Н. Маянский
Заведующий кафедрой микробиологии Нижегородской медицинской академии

В.В. Тец
Заведующий кафедрой микробиологии Санкт-Петербургской медицинской академии им. ак. И.П. Павлова

Введение

С момента появления в 70-х годах и до настоящего времени метициллинрезистентные стафилококки и, прежде всего, метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций. Частота MRSA в структуре стафилококковых инфекций за последние годы резко возросла во всём мире (например в США - с 2% в 1975 г. до 35% в 1996 г.).

Резистентность стафилококков к оксациллину (метициллину) может быть обусловлена тремя основными механизмами:

• продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) - ПСБ-2а (фермента, участвующего в синтезе клеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном «mecА» - классическая или истинная резистентность к метициллину (оксациллину);
• инактивацию вследствие гиперпродукции бета-лактамаз;
• модификацию нормальных ПСБ.

С клинической точки зрения важно дифференцировать штаммы с классической («mecА»-обусловленной) резистентностью, от штаммов с двумя другими редко встречающимися механизмами резистентности, обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью терапия бета-лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) будет неэффективна, кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Фенотипические характеристики, которые могут помочь дифференцировать три перечисленные выше механизма резистентности, изложены в таблице:

Таблица. Типы резистентности к метициллину (оксациллину) у стафилококков

Штаммы с классическим типом резистентности могут в свою очередь быть гомо- или гетерогенными по типу экспрессии резистентности. При гомогенном типе экспрессии практически все микробные клетки проявляют резистентность в стандартных in vitro тестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клеток проявляет резистентность фенотипически. Нередко только 1 из 10-100 млн. клеток в популяции с наличием гена mecА экспрессирует резистентность, что ведёт к получению пограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину (МПК 2-8 мг/л). Резистентность, обусловленная гиперпродукцией бета-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, также приводит к получению пограничных значений МПК. Однако, резистентность к оксациллину, обусловленную гиперпродукцией бета-лактамаз, можно легко отличить от классической резистентности по обратимости резистентности при использовании ингибиторов бета-лактамаз.

В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуценты бета-лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.

Наличие классической резистентности наиболее легко определить методом скрининга так как рост микробных клеток с неклассическими типами резистентности обычно ингибируется.

Примечание

Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности при хранении по сравнению с метициллином.

Принцип

Для идентификации резистентности к оксациллину (метициллину) у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий:

1. Наличие в агаре NaCl в концентрации 4%
2. Сниженная температура инкубации - при 35°С
3. Строгое соблюдение длительности инкубации: 24 часа для S.aureus и 48 часов для коагулаза(-) стафилококков
4. Стандартизированное число микроорганизмов - 1,5 х 10⁸
5. рН 7,2-7,4, так как при более низком рН увеличивается число ложноотрицательных результатов

Микроорганизм

Чистая культура Staphylococcus spp., инкубированная в течение 18-24 часов на кровяном агаре.

Материалы

1. Агар Мюллер-Хинтон с добавлением 4% NaCl (4 г на 100 мл среды) и 6 мг/л оксациллина (0,6 мг на 100 мл среды). Агар Мюллер-Хинтон хранится при 2-8°С, готовится согласно прописи на этикетке, 4% NaCl добавляется до автоклавирования.
2. Субстанция оксациллина с известной активностью предварительно растворяется в стерильной дистиллированной воде (расчет концентрации оксациллина проводят с учетом его активности) и добавляется в охлаждённый на водяной бане до 48-50°С агар Мюллер-Хинтон. Приготовленный агар разливается по чашкам с толщиной слоя агара 3-4 мм (на чашку диаметром 100 мм - 25 мл). Готовые чашки со средой хранятся в пластиковых пакетах при температуре 4-8°С не более 5 суток.
3. Для контроля роста необходимо также приготовить чашки с агаром без антибиотика.
4. Кровяной агар с чистой культурой стафилококка, инкубированной в течение 18-24 ч.
5. Стерильный физиологический раствор.
6. Стандарт мутности 0,5 по МакФарланду.
7. Стерильные тампоны или микропипетка (10 мкл).
8. Термостат с температурой 35°С.

Контроль качества

1. Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллер-Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
2. Контрольные штаммы (могут быть предоставлены Институтом антимикробной химиотерапии):
   S.aureus ATCC 38591 - резистентный.
   S.aureus ATCC 29213 - чувствительный.

Постановка теста

Приготовление инокулюма

Бактериальную взвесь стафилококка готовят из нескольких колоний с одинаковой морфологией на стерильном физиологическом растворе (3 мл) и доводят до мутности 0,5 по Мак Фарланду (1,5x10⁸ КОЕ/мл).

Инокуляция

1. Метод I (микропипеткой)
   а) приготовить разведение 1:100 стандартного инокулюма 0,5 по МакФарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5 x 10⁶ КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физ. раствора).
   б) с помощью микропипетки нанесите каплю (10 мкл) разведённой стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.
2. Метод II (с помощью тампона)
   а) погрузите стерильный ватный тампон в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по МакФарланду), затем отожмите избыток влаги о стенку пробирки
   б) коснитесь тампоном поверхности агара с оксациллином.

Инкубация

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре +35°С в течение полных 24 часов, а коагулаза(-) стафилококков - в течение 48 часов.

Примечание

Среда АГВ не может быть рекомендована для постановки теста в связи с высокой частотой ложноположительных результатов.

Учет результата

Интерпретация

1. Появление видимого роста более 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину).
2. При отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамма учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
3. При получении сомнительных результатов, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

Представление результата

1. S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis), чувствительный к метициллину (оксациллину).
2. S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis) резистентный к метициллину (MRSA или MRSE).

Ограничения метода

1. Скрининг на агаре с оксациллином предназначен для фенотипического определения штаммов имеющих ген mecA, однако, штаммы с другими типами резистентности иногда могут давать ложноположительный результат.
2. Применение метода скрининга для выявления резистентности к оксациллину (метициллину) менее надёжен у коагулаза(-) стафилококков, чем у S.aureus.

Примечание

Оксациллин, в сравнении с метициллином, менее стабилен к действию стафилококковых бета-лактамаз, что может привести к получению большего числа ложноположительных результатов, чем при использовании метициллина. В то же время, метициллин, в сравнении с оксациллином, значительно менее стабилен при хранении, что и ограничивает его применение.

Ванкомицин-резистентный S.aureus

О возможности появления ванкомицинрезистентных S.aureus стали задумываться около десяти лет назад после сообщений о появлении резистентности к ванкомицину у энтерококков. Однако, прошло более десяти лет до появления первого сообщения в 1996 г. о выделении метициллинрезистентного S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину (МПК 8 мг/л) из клинического материала. Несмотря на значение МПК к ванкомицину, соответствующее диапазону умеренной резистентности, данный штамм был зарегистрирован как VRSA (ванкомицинрезистентный S.aureus), ввиду клинической неэффективности ванкомицина. У этого штамма не было найдено ни одного из ранее известных механизмов резистентности к ванкомицину; отмечено только увеличение толщины клеточной стенки и концентрации пенициллинсвязывающих белков 2 и 2а. Далее, одно за другим последовали сообщения о выделении из клинического материала штаммов S.aureus с МПК к ванкомицину 8 мг/л и получивших обозначение VISA (S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину).

В результате углубленного исследования ванкомицинрезистентности у MRSA, при скрининге более чем 2000 штаммов из различных стационаров, было выявлено от 1% до 25% (!) штаммов с гетерогенной (индуцибельной) резистентностью к ванкомицину, экспрессирующих её с частотой около 1 клетки на миллион. Такие штаммы могут являться предшественниками VRSA.

Специалисты до сих пор не пришли к согласию, какой термин использовать (VRSA или VISA), что связано с тем, что, несмотря на значения МПК, соответствующее диапазону умеренной резистентности, налицо клиническая неэффективность ванкомицина при терапии VRSA и VISA инфекций. Другими словами, при отсутствии резистентности с фармакологической точки зрения, эти штаммы резистентны к ванкомицину с клинической и биологической точек зрения.

Многие специалисты предлагают свои методы для скрининга ванкомицинрезистентности у стафилококков, однако, до сих пор не разработано общепринятых стандартов. Таким образом, чрезвычайно важным является разработка методов лабораторной диагностики и мониторинга ванкомицинрезистентности, особенно у пациентов, получающих или получавших терапию ванкомицином/тейкопланином и при неэффективности этой терапии. Следует разработать методики для контроля за VRSA-инфекциями, предпринять меры по изоляции больных и носителей для предупреждения распространения VRSA. Кроме того, политика применения антибиотиков должна предусматривать снижение необоснованного назначения ванкомицина.

В России пока что не было описано ни одного штамма S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину, вероятнее всего, в связи с редким использованием ванкомицина в клинической практике.

Литература

1. Сидоренко С.В. Метициллинрезистентные стафилококки. Антибиотики и химиотерапия, 1995; 11: 12: 57-69.
2. Performance standarts for antimicrobial susceptibility testing, NCCLS; Ninth information supplement, 1999; M100-S9: 19: 18.
3. Isenberg H.D. Essential procedures for clinical microbilogy. 1998; 232-234.
4. Swenson J.M., e.a. Special tests for detecting antibacterial resistance. In Murray PR, e.a. eds. Manual Clin. Microbiol. 1995; 1359-1360.
5. Wenzel R.P., Edmind M.B. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: infection control considerations. Clin. Infect. Dis. 1998; 27: 245-251.
6. Working party report. Revised guidelines for the control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in hospitals. J. Hosp. Infect. 1998; 39: 253-290.